Cara analisa Microbiologi yang dilakuakn
di perusahaan tempak Prakerin
Karena Perusahaan tempat kami melakukan
Prakerin adalah perusahaan yang bergerak dibidang pengolahan pangan dengan
bahan dasar Daging sehingga produk yang dihasilkan adalah makanan olahan daging
seperti berbaagai macam sosis,berger, smoke beef, Cornet dll.
Analisa yang dilakukan adalah sebagai
berikut :
a.
Analisa TPC (Total Plate Count) Hitungan cawan total
b.
Analisa E.Coli
c. Analisa Coliform
d. Analisa Staphylococcus
aureus
2. Prosedur Analisa
a. Analisa TPC (Total Plate Count)/
Hitungan cawan total
Pertumbuhan mikroorganisme yang
membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari
satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran
bakteri yang ada pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat dihitung
dengan berbagai macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Ada 2
macam cara perhitungan jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara
langsung dan tidak langsung.Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu
jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup
sedangkan perhitungan jumlah miroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba
dihitung secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk
menentukan jumlah mikroba yang hidup saja, ini tergantung cara-cara yang
digunakan. Untuk menentukan jumlah miroba yang hidup dapat dilakukan setelah
larutan bahan atau biakan mikroba diencerkan dengan factor pengenceran tertentu
dan ditumbuhkan dalam media dengan cara-cara tertentu tergantung dari macam dan
sifat-sifat mikroba
Analisa TPC dilakukan adalah untuk
mengetahui pada sampel. angka lempeng total yaitu jumlah bakteri mesofil aerob
yang hidup pada sampel. Bakteri mesofil aerob adalah golongan bakteri yang
tumbuh baik pada suhu 25-40˚C dalam suasana mengandung asam.
Sebelum
melakukan praktikum penghitungan bakteri atau mikroba terlebih dahulu kita
menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Setelah apa yang dibutuhkan telah
siap maka kita dapat melakukan praktikum penghitungan bakteri atau mikroba.
A.
Alat
-
Erlenmeyer
– Penangas Air
-
Petridish
– Lemari Pengeram
-
Pipet Ukur 10
mL
– Alat Penghitung Koloni (Colony
Counter)
-
Tabung
Reaksi
– Alat Penghomogen (Vortex)
-
Rak Tabung
Reaksi
– Tissue
-
Bunsen
B.
Bahan
-
Aquades
-
Potatoes Dextrose Agar ( PDA )
-
Sampel SOSIS
-
Alkohol 80 %
C. Prosedur
1.
Menyiapkan
alat dan bahan yang akan digunakan.
2.
Menyemprot
meja kerja dan tangan praktikan dengan alcohol 80%
3.
Membungkus
cawan petri, tabung reaksi, pipet ukur dengan kertas buram, (tabung reaksi
masing – masing diisi 9 mL Buffered Peptone Water (BPW) dan lubang tabung
reaksi ditutup dengan kapas).
4.
Membuat
media Potatoes Dextrose Agar ( PDA ).
5.
Mensterilisasi
semua alat yang telah dibungkus kertas buram pada autoclave selama 15 menit
pada suhu 121˚C.
6.
Mendinginkan
alat dan bahan yang telah disterilisasi.
7.
Melakukan
pengekstrakan, sampel dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL Aquades
yang telah steril (101) dilakukan secara aseptis, mengocok 25 kali
dengan vortex.
8.
Melakukan
pengenceran berikutnya yaitu memipet 1 mL dari tabung reaksi 101
dimasukan ke tabung reaksi dan diencerkan, pengenceran 102,
memvortex dan memipet 1 mL lagi di masukan ke cawan petri dilakukan secra
aseptis.
9.
Melakukan
pengenceran berikutnya hingga pengenceran 105
10.
Cawan
petri yang telah terisi digoyang-goyangkan.
11.
Menuangkan
media ke masing-masing cawan, tungu hingga media padat lalu balikkan posisi
cawan
12.
Memasukan
cawan petri ke dalam incubator dengan posisi terbalik pada suhu 35±1˚C selama
24-48 jam
13.
Mencatat
pertumbuhan koloni pada masing-masing cawan yang mengandung 25-250 koloni dan
melihat bentuknya dengan colony counter.
b.
Analisa
E Coli (Escherichia coli) dan Coliform
Bakteri dapat ditemukan di hampir
semua tempat: di tanah, air,
udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai
agen parasit (patogen), bahkan dalam tubuh manusia Pada
umumnya, bakteri berukuran 0,5-5 μm, tetapi ada bakteri tertentu yang dapat
berdiameter hingga 700 μm, yaitu Thiomargarita Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur,
tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan). Beberapa jenis bakteri bersifat
motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel.
A. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah:
- Sampel air yang telah diklorinasi
- Lactose Broth
- Briliant Green Lactose
Bile Broth (BGLBB)
- Aquades
-
DPD Free Chlorin
- EMB Agar (Eosin
Metylen Blue)
B. Alat
Alat-alat yang
dogunakan adalah:
-
Tabung reaksi
-
Tabung durham
- Neraca
-
Autoklaf
-
Pipet mohr 10 mL
-
Erlenmeyer
-
Labu takar
-
Inkubator (37,5 
C)
-
Botol contoh
-
Kapas
- Pembakar spirtus
-
Cawan petri
C. Metode dan Cara Kerja
Dalam praktik kerja lapang (PKL) ini dilakukan analisis
mikrobiologi dengan menggunakan metode (Most
Probable Number) MPN atau (Angka Paling Mungkin) APM dengan acuan APHA9221
B-2005.
D. Prinsip
a) Total coliform
Untuk menghitung bakteri Coliform ( Total Colifrom)
dapat digunakan metode MPN. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung
reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah diinkubasi pada
suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan
mengamati timbulnya kekruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil
(tabung durham) yang diletakan terbalik, yaitu jasad renik yang membentuk gas
(Waluyo, 2008). Untuk menguji sifat itu diperlukan beberapa tahap pengujian
yaitu:
1. Uji Pendugaan
Uji pendugaan
adalah uji khas bakteri coliform dengan menggunakan media laktosa, di mana bakteri mampu
menggunakan laktosa sebagai sumber karbon ditandai dengan terbentuknya asam dan
gas yang dapat dideteksi dengan indikator tertentu, sedangkan untuk mendeteksi
adanya gas digunakan tabung durham terbalik, hasil positif yang ditandai dengan
terbentuknya asam dan gas lalu dilanjutkan ke uji penegasan.
2. Uji Penegasan
Uji penegasan merupakan uji lanjuta dari uji pendugaan
adanya bakteri coloform secara pasti, uji ini menggunakan media BGLBB yang berisi
tebung durham terbalik, dimana media ini digunakan dengan tujian untuk
menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan mengiatkan pertumbuhan bakteri
gram negati, hasil yang positif ditandai dengan adanya gas dalam tabung durham, nilai ini ditunjukan sebagai
angka rujukan pada daftar JPT.
b) E. coli
Metode hitungan cawan adalah salah satu
metode yang dapat digunakan untuk menguji kualitas air minum. Metode hitungan
cawan merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jasad renik,
dengan prinsip jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium
agar maka sel jasad renik tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni
yang dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz,
1992).
Pada
mengidentifikasi E. coli digunakan
media agar EMB (Eosin Metylen Blue),
media agar EMB bila terdapat bakteri E.
coli jika positif akan terbentuk warna hijau terang pada media agar EMB.
E. Cara Kerja
Berikut
ini adalah cara kerja dalam analisis mikrobiologi yaitu pembuatan media ,
sterilisasi alat dan media dan pemeriksaan Total
coliform dan E. coli.
Pembuatan
Media
a) Pembuatan Media Total coliform
1. Ditimbang 1,3 gram Lactose Broth dimasukkan dalam wadah gelas piala
dilarutkan dengan 100 mL aquades. Dipipet masing-masing 10mL ke dalam 10 tabung
reaksi.
2. Ditimbang
0.65 gram media Lactose Broth
dimasukkan ke dalam wadah gelas piala
dilarutkan dengan 25 mL aquades. Dipipet masing-masing 5 mL ke dalam 5 tabung
reaksi.
3. Ditimbang
6 gram media BGLBB (Brilliant Green
Lactose Bile Broth) dimasukkan dalam gelas piala yang dilarutkan dengan 150
mL aquades. Dipipet masing-masing 10 mL ke dalam 15 tabung reaksi.
4. Dimasukkan
1 tabung durham secara terbalik ke dalam tiap tabung.
5. Ditutup
mulut tabung reaksi dengan disumbat kapas, dan sumbat tersebut harus sedemikian
kuat sehingga dapat dicabut dari tabungnya dengan menggunakan kelingking.
6. Dimasukkan
tabung-tabung tersebut ke dalam beaker glass, ditutup bagian atasnya dengan
kertas kemudian diikat erat-erat dengan karet.
7. Media
siap untuk disterelisasi.
b) Pembuatan Media E. coli
1. Ditimbang
3,75 gram media agar EMB (Eosin Metylen
Blue) dimasukkan dalam wadah Erlenmeyer
dilarutkan dengan 100 mL aquades.
2. Ditutup
mulut Erlenmeyer dengan disumbat kapas, dan ssumbat tersebut harus sedemikian
kuat sehingga dapat dicabut dari tabungnya dengan menggunakan kelingking.
3. Ditutup
bagian atas erlenmeyer dengan kertas kemudian diikat erat-erat dengan karet.
4. Media
siap untuk disterilisasi.
Srelisasi
Berikut
ini adalah cara kerja strelisasi alat dan media pada analisa mikrobologi.
a) Sterisasi Alat
1. Alat-alat
yang akan disterisasi dibersihkan dan dikeringkan
2. Lalu
dibungkus dengan kertas (untuk pipet dan pinggan petri)
3. Dimasukan
dalam autoklaf dan diatur suhunya sampai mencapai 121°C selama 20 menit
b)
Sterelisasi Media
1. Media
yang akan disterelisasi dimasukan kedalam autoklaf
2. Suhu
diatur hingga 121°Cselam 60 menit
3. Autoklaf
dimatikan dan dibiarkan manomater sampai menunjukan angka nol, autoklaf dibuka
dan dibiarkan hingga dingin.
Pemerikasaan
Total coliform dan
E. coli
Berikut
ini adalah cara kerja pemeriksaan Total
colifrom dan E. coli. Untuk Total coliform dengan beberapa tahap
pengujian yaitu : uji pedugaan dan uji penegasan.
a) Uji Pendugaan
1. Pengerjaan
contoh dilakukan secara aseptik, dengan cara didekatkan dengan api.
2. Dipipet
contoh masing-masing 10 mL ke dalam tabung medium.
3. Dipipet
contoh masing-masing 1 mL ke dalam tabung medium.
4. Dipipet
contoh masing-masing 0,1 mL ke dalam tabung medium.
5. Tabung
digoyang-goyangkan sehingga contoh tercampur dengan medium secara merata.
6. Diinkubasi
semua tabung pada suhu 35°C selama 24 jam.
7. Dicatat
tabung-tabung yang menujukkan reaksi positif , yaitu terbentuk asam dan
gelembung gas.
8. Tabung-tabung
yang belum menunjukkan adanya gelembung gas diinkubasikan kembali pada suhu
35°C selama 24 jam.
b) Uji Penegasan
1. Pengerjaan
inokulasi dilakukan secara aseptis, dengan cara di dekatkan dengan api.
2. Digoyang-goyangkan
tabung dari hasil uji pendugaan yang menunjukkan reaksi positif.
3. Dari
tabung-tabung tersebut, diinokulasikan sebanyak 1 mL ke dalam tabung reaksi
medium BGLBB (Brilliant Green Lactose
Bile Broth) untuk uji Total coliform.
4. Tabung-tabung
tersebut diinkubasikan pada suhu 35°C selama
48 jam.
5. Adanya
gelembung gas menunjukkan Total coliform
positif.
6. Dihitung
jumlah Total coliform per 100 mL
contoh dengan menggunakkan daftar Pumlah Perkiraan Terdekat (JPT)
7. Apabila
hasil tabung tidak terdapat pada kombinasi tabung yang positif pada tabel JPT,
maka jumlah bakteri per 100 mL harus dihitung dengan menggunakkan rumus :
Jumlah bakteri (JPT/100 mL) = A x
100
√B x C
Keterangan : A :
jumlah tabung yang positif
B
: jumlah (mL) contoh dalam tabung negatif
C
: Volume (mL) contoh dalam semua tabung
8. Apabila
volume semua
contoh tidak sesuai dngan ketentuan tabel JPT, maka jumlah bakteri per 100 mL
dihitung dengan rumus :
Jumlah
bakteri (JPT/100 mL) = Z x 100
Y
Keterangan : Z :
jumlah bakteri dari tabel JPT
Y : Volume
(mL) contoh terbesar
c) Uji E. coli
1. Menyiapkan
alat dan bahan yang akan di gunakan.
2. Menimbang
media EMB dan agar sesuai dengan kebutuhan.
3. Melakukan
pemanasan untuk sterilisasi media EMB dengan
menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C dan waktu 50 menit.
4. Melakukan
penyemprotan tangan dengan menggunakan alkohol dan menyalakan lampu spirtus.
5. Melakukan
inokulasi dengan memasukan sampel air ke dalam cawan petri dengan memipet 1 mL
sampel dengan teknik penanaman goresan sinambung (Streak).
6. Dituangkan
media EMB ke dalam cawan petri yang sudah terdapat sampel.
7. Melakukan
inkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 350C.
8. Melakukan
pengamatan yaitu dengan cara melihat warna yang di timbulkan oleh bakteri
tersebut.jika berwarna hijau metalik berarti positif keberadaan bakteri E. coli terdapat dalam sampel air.
c.
Analisa Staphylococcus
aureus
Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri
gram positif yang
menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora
dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter
sekitar 0,8-1,0 µm. S. aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37oC
dengan waktu pembelahan 0,47 jam S. aureus merupakan mikroflora
normal manusia.
Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernapasan atas dan kulitKeberadaan S.
aureus pada saluran pernapasan atas dan kulit pada individu jarang
menyebabkan penyakit, individu sehat biasanya hanya berperan sebagai
karier Infeksi serius akan terjadi
ketika resistensi inang melemah karena adanya perubahan hormon; adanya
penyakit, luka, atau perlakuan menggunakan steroid atau obat lain yang memengaruhi
imunitas sehingga terjadi pelemahan inang
Infeksi
S. aureus diasosiasikan dengan beberapa kondisi patologi, diantaranya
bisul, jerawat, pneumonia, meningitis, dan arthritits. Sebagian besar penyakit yang
disebabkan oleh bakteri ini memproduksi nanah, oleh karena itu bakteri ini
disebut piogenik
1.
Penentuan
Staphylococcus aureus dengan
metode Hitungan Cawan
a.
Prinsip
Prinsip dari analisa ini
adalah dengan menuangkan BPA kedalam cawan yang stereil, biarkan membeku dan
sebarkan sample sebanyak 1 ml ke dalam media yang telah siap tersebut.Sedangkan
konfirmasi koloni Staphylococcus aureus dengan menggunakan metode koagulasi
dan uji tambahan. Metode ini cocok untuk
mengetahui makanan yang diduga mengandung koloni lebih dari 100 Staphylococcus aureus/g.
b.
Peralatan
·
Autoclave
·
Alat
hitung koloni
·
Timbangan
analitik
·
Botol
pengencer
·
Batang
gelas bengkok
·
Blender
·
Cawan
petri
·
Gelas
ukur
·
Gelas
preparat
·
Incubator
·
Membrane
apparatus
·
membran
filter
·
pipet
gelas
·
waterbath
·
Pipet
Pasteur
c.
Media
·
BPA
·
BHIB
·
Coagulase
plasma dengan EDTA
·
Larutan
Butterfild phosphat buffered
·
Paraffin
oil steril
·
Pereaksi
pewarnaan gram
·
Pereaksi
katalese
·
Purple
Carbohydrate Broth
·
Toluidine
blue
·
Trypticase
d.
Kondisi
pengujian
Kondisi
pengujian harus dalam kndisi steril baik personal, peralatan dan lingkungan
harus dalm kondisi steril agar sample yang dianalisa idak terkontaminasi. Media
yang dikgunakna harus dalam kondisi kering ketika ingin dibuat. Bila Staphylococcus
aureus tidak tumbuh dalm waktu 48jam maka dapat
dilanjut sampai 72 jam
e.
Prosedur
·
Potong kecil-kecil sample
yang telah diambil secara acak
·
Timbang sample hingga 25
g
·
Masukan dalam wadah /
plastic steril
·
Tambahkan larutan 225 ml Butterfild phosphat buffered
homogenkan selama 2 menit( homogenate ini merupakan larutan pengencer 10¹
·
Kemudian
lakukan pengenceran hingga pengenceran kelima
·
Kemudian
isolasi Staphylococcus aureus dengan
menggunakn cawan dan retaken dangan menggunakan gelas bengkok dan iarkan selama
48 jam.
·
Lakukan perhitungan
koloni
·
Ambil dua atau lebh
koloni terduga unuk dilakukan uji koagulase dan uji tambahan
·
Lakukan
uji koagulase
·
Lakuka
uji tambahan
Apabila tidak terbentuk
koagulan maka negative mengadung Staphylococcus aureus
SUMBER: http://ellyebintangsenja.blogspot.com/2013_11_01_archive.html
