Analisa Microbiologi

20.33 |

Cara analisa Microbiologi yang dilakuakn di perusahaan tempak Prakerin

Karena Perusahaan tempat kami melakukan Prakerin adalah perusahaan yang bergerak dibidang pengolahan pangan dengan bahan dasar Daging sehingga produk yang dihasilkan adalah makanan olahan daging seperti berbaagai macam sosis,berger, smoke beef, Cornet dll.

Analisa yang dilakukan adalah sebagai berikut :

a. Analisa TPC (Total Plate Count) Hitungan cawan total

b. Analisa E.Coli

c. Analisa Coliform

d. Analisa Staphylococcus aureus

2. Prosedur Analisa

a. Analisa TPC (Total Plate Count)/ Hitungan cawan total

Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Ada 2 macam cara perhitungan jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak langsung.Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup sedangkan perhitungan jumlah miroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja, ini tergantung cara-cara yang digunakan. Untuk menentukan jumlah miroba yang hidup dapat dilakukan setelah larutan bahan atau biakan mikroba diencerkan dengan factor pengenceran tertentu dan ditumbuhkan dalam media dengan cara-cara tertentu tergantung dari macam dan sifat-sifat mikroba

Analisa TPC dilakukan adalah untuk mengetahui pada sampel. angka lempeng total yaitu jumlah bakteri mesofil aerob yang hidup pada sampel. Bakteri mesofil aerob adalah golongan bakteri yang tumbuh baik pada suhu 25-40˚C dalam suasana mengandung asam.

Sebelum melakukan praktikum penghitungan bakteri atau mikroba terlebih dahulu kita menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Setelah apa yang dibutuhkan telah siap maka kita dapat melakukan praktikum penghitungan bakteri atau mikroba.

A. Alat

- Erlenmeyer – Penangas Air

- Petridish – Lemari Pengeram

- Pipet Ukur 10 mL – Alat Penghitung Koloni (Colony Counter)

- Tabung Reaksi – Alat Penghomogen (Vortex)

- Rak Tabung Reaksi – Tissue

- Bunsen

B. Bahan

- Aquades

- Potatoes Dextrose Agar ( PDA )

- Sampel SOSIS

- Alkohol 80 %

C. Prosedur

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Menyemprot meja kerja dan tangan praktikan dengan alcohol 80%

3. Membungkus cawan petri, tabung reaksi, pipet ukur dengan kertas buram, (tabung reaksi masing – masing diisi 9 mL Buffered Peptone Water (BPW) dan lubang tabung reaksi ditutup dengan kapas).

4. Membuat media Potatoes Dextrose Agar ( PDA ).

5. Mensterilisasi semua alat yang telah dibungkus kertas buram pada autoclave selama 15 menit pada suhu 121˚C.

6. Mendinginkan alat dan bahan yang telah disterilisasi.

7. Melakukan pengekstrakan, sampel dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL Aquades yang telah steril (10¹) dilakukan secara aseptis, mengocok 25 kali dengan vortex.

8. Melakukan pengenceran berikutnya yaitu memipet 1 mL dari tabung reaksi 10¹ dimasukan ke tabung reaksi dan diencerkan, pengenceran 10², memvortex dan memipet 1 mL lagi di masukan ke cawan petri dilakukan secra aseptis.

9. Melakukan pengenceran berikutnya hingga pengenceran 10⁵

10. Cawan petri yang telah terisi digoyang-goyangkan.

11. Menuangkan media ke masing-masing cawan, tungu hingga media padat lalu balikkan posisi cawan

12. Memasukan cawan petri ke dalam incubator dengan posisi terbalik pada suhu 35±1˚C selama 24-48 jam

13. Mencatat pertumbuhan koloni pada masing-masing cawan yang mengandung 25-250 koloni dan melihat bentuknya dengan colony counter.

b. Analisa E Coli (Escherichia coli) dan Coliform

Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat: di tanah, air, udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit (patogen), bahkan dalam tubuh manusia Pada umumnya, bakteri berukuran 0,5-5 μm, tetapi ada bakteri tertentu yang dapat berdiameter hingga 700 μm, yaitu Thiomargarita Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur, tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan). Beberapa jenis bakteri bersifat motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel.

A. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah:

- Sampel air yang telah diklorinasi

- Lactose Broth

- Briliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)

- Aquades

- DPD Free Chlorin

- EMB Agar (Eosin Metylen Blue)

B. Alat

Alat-alat yang dogunakan adalah:

- Tabung reaksi

- Tabung durham

- Neraca

- Autoklaf

- Pipet mohr 10 mL

- Erlenmeyer

- Labu takar

- Inkubator (37,5

- Botol contoh

- Kapas

- Pembakar spirtus

- Cawan petri

C. Metode dan Cara Kerja

Dalam praktik kerja lapang (PKL) ini dilakukan analisis mikrobiologi dengan menggunakan metode (Most Probable Number) MPN atau (Angka Paling Mungkin) APM dengan acuan APHA9221 B-2005.

D. Prinsip

a) Total coliform

Untuk menghitung bakteri Coliform ( Total Colifrom) dapat digunakan metode MPN. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakan terbalik, yaitu jasad renik yang membentuk gas (Waluyo, 2008). Untuk menguji sifat itu diperlukan beberapa tahap pengujian yaitu:

1. Uji Pendugaan

Uji pendugaan adalah uji khas bakteri coliform dengan menggunakan media laktosa, di mana bakteri mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon ditandai dengan terbentuknya asam dan gas yang dapat dideteksi dengan indikator tertentu, sedangkan untuk mendeteksi adanya gas digunakan tabung durham terbalik, hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya asam dan gas lalu dilanjutkan ke uji penegasan.

2. Uji Penegasan

Uji penegasan merupakan uji lanjuta dari uji pendugaan adanya bakteri coloform secara pasti, uji ini menggunakan media BGLBB yang berisi tebung durham terbalik, dimana media ini digunakan dengan tujian untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan mengiatkan pertumbuhan bakteri gram negati, hasil yang positif ditandai dengan adanya gas dalam tabung durham, nilai ini ditunjukan sebagai angka rujukan pada daftar JPT.

b) E. coli

Metode hitungan cawan adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk menguji kualitas air minum. Metode hitungan cawan merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jasad renik, dengan prinsip jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar maka sel jasad renik tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz, 1992).

Pada mengidentifikasi E. coli digunakan media agar EMB (Eosin Metylen Blue), media agar EMB bila terdapat bakteri E. coli jika positif akan terbentuk warna hijau terang pada media agar EMB.

E. Cara Kerja

Berikut ini adalah cara kerja dalam analisis mikrobiologi yaitu pembuatan media , sterilisasi alat dan media dan pemeriksaan Total coliform dan E. coli.

Pembuatan Media

a) Pembuatan Media Total coliform

1. Ditimbang 1,3 gram Lactose Broth dimasukkan dalam wadah gelas piala dilarutkan dengan 100 mL aquades. Dipipet masing-masing 10mL ke dalam 10 tabung reaksi.

2. Ditimbang 0.65 gram media Lactose Broth dimasukkan ke dalam wadah gelas piala dilarutkan dengan 25 mL aquades. Dipipet masing-masing 5 mL ke dalam 5 tabung reaksi.

3. Ditimbang 6 gram media BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) dimasukkan dalam gelas piala yang dilarutkan dengan 150 mL aquades. Dipipet masing-masing 10 mL ke dalam 15 tabung reaksi.

4. Dimasukkan 1 tabung durham secara terbalik ke dalam tiap tabung.

5. Ditutup mulut tabung reaksi dengan disumbat kapas, dan sumbat tersebut harus sedemikian kuat sehingga dapat dicabut dari tabungnya dengan menggunakan kelingking.

6. Dimasukkan tabung-tabung tersebut ke dalam beaker glass, ditutup bagian atasnya dengan kertas kemudian diikat erat-erat dengan karet.

7. Media siap untuk disterelisasi.

b) Pembuatan Media E. coli

1. Ditimbang 3,75 gram media agar EMB (Eosin Metylen Blue) dimasukkan dalam wadah Erlenmeyer dilarutkan dengan 100 mL aquades.

2. Ditutup mulut Erlenmeyer dengan disumbat kapas, dan ssumbat tersebut harus sedemikian kuat sehingga dapat dicabut dari tabungnya dengan menggunakan kelingking.

3. Ditutup bagian atas erlenmeyer dengan kertas kemudian diikat erat-erat dengan karet.

4. Media siap untuk disterilisasi.

Srelisasi

Berikut ini adalah cara kerja strelisasi alat dan media pada analisa mikrobologi.

a) Sterisasi Alat

1. Alat-alat yang akan disterisasi dibersihkan dan dikeringkan

2. Lalu dibungkus dengan kertas (untuk pipet dan pinggan petri)

3. Dimasukan dalam autoklaf dan diatur suhunya sampai mencapai 121°C selama 20 menit

b) Sterelisasi Media

1. Media yang akan disterelisasi dimasukan kedalam autoklaf

2. Suhu diatur hingga 121°Cselam 60 menit

3. Autoklaf dimatikan dan dibiarkan manomater sampai menunjukan angka nol, autoklaf dibuka dan dibiarkan hingga dingin.

Pemerikasaan Total coliform dan E. coli

Berikut ini adalah cara kerja pemeriksaan Total colifrom dan E. coli. Untuk Total coliform dengan beberapa tahap pengujian yaitu : uji pedugaan dan uji penegasan.

a) Uji Pendugaan

1. Pengerjaan contoh dilakukan secara aseptik, dengan cara didekatkan dengan api.

2. Dipipet contoh masing-masing 10 mL ke dalam tabung medium.

3. Dipipet contoh masing-masing 1 mL ke dalam tabung medium.

4. Dipipet contoh masing-masing 0,1 mL ke dalam tabung medium.

5. Tabung digoyang-goyangkan sehingga contoh tercampur dengan medium secara merata.

6. Diinkubasi semua tabung pada suhu 35°C selama 24 jam.

7. Dicatat tabung-tabung yang menujukkan reaksi positif , yaitu terbentuk asam dan gelembung gas.

8. Tabung-tabung yang belum menunjukkan adanya gelembung gas diinkubasikan kembali pada suhu 35°C selama 24 jam.

b) Uji Penegasan

1. Pengerjaan inokulasi dilakukan secara aseptis, dengan cara di dekatkan dengan api.

2. Digoyang-goyangkan tabung dari hasil uji pendugaan yang menunjukkan reaksi positif.

3. Dari tabung-tabung tersebut, diinokulasikan sebanyak 1 mL ke dalam tabung reaksi medium BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) untuk uji Total coliform.

4. Tabung-tabung tersebut diinkubasikan pada suhu 35°C selama 48 jam.

5. Adanya gelembung gas menunjukkan Total coliform positif.

6. Dihitung jumlah Total coliform per 100 mL contoh dengan menggunakkan daftar Pumlah Perkiraan Terdekat (JPT)

7. Apabila hasil tabung tidak terdapat pada kombinasi tabung yang positif pada tabel JPT, maka jumlah bakteri per 100 mL harus dihitung dengan menggunakkan rumus :

Jumlah bakteri (JPT/100 mL) = A x 100

√B x C

Keterangan : A : jumlah tabung yang positif

B : jumlah (mL) contoh dalam tabung negatif

C : Volume (mL) contoh dalam semua tabung

8. Apabila volume semua contoh tidak sesuai dngan ketentuan tabel JPT, maka jumlah bakteri per 100 mL dihitung dengan rumus :

Jumlah bakteri (JPT/100 mL) = Z x 100

Keterangan : Z : jumlah bakteri dari tabel JPT

Y : Volume (mL) contoh terbesar

c) Uji E. coli

1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan di gunakan.

2. Menimbang media EMB dan agar sesuai dengan kebutuhan.

3. Melakukan pemanasan untuk sterilisasi media EMB dengan menggunakan autoklaf dengan suhu 121⁰C dan waktu 50 menit.

4. Melakukan penyemprotan tangan dengan menggunakan alkohol dan menyalakan lampu spirtus.

5. Melakukan inokulasi dengan memasukan sampel air ke dalam cawan petri dengan memipet 1 mL sampel dengan teknik penanaman goresan sinambung (Streak).

6. Dituangkan media EMB ke dalam cawan petri yang sudah terdapat sampel.

7. Melakukan inkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 35⁰C.

8. Melakukan pengamatan yaitu dengan cara melihat warna yang di timbulkan oleh bakteri tersebut.jika berwarna hijau metalik berarti positif keberadaan bakteri E. coli terdapat dalam sampel air.

c. Analisa Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm. S. aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37^oC dengan waktu pembelahan 0,47 jam S. aureus merupakan mikroflora normal manusia. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernapasan atas dan kulitKeberadaan S. aureus pada saluran pernapasan atas dan kulit pada individu jarang menyebabkan penyakit, individu sehat biasanya hanya berperan sebagai karier Infeksi serius akan terjadi ketika resistensi inang melemah karena adanya perubahan hormon; adanya penyakit, luka, atau perlakuan menggunakan steroid atau obat lain yang memengaruhi imunitas sehingga terjadi pelemahan inang

Infeksi S. aureus diasosiasikan dengan beberapa kondisi patologi, diantaranya bisul, jerawat, pneumonia, meningitis, dan arthritits. Sebagian besar penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini memproduksi nanah, oleh karena itu bakteri ini disebut piogenik

1. Penentuan Staphylococcus aureus dengan metode Hitungan Cawan

a. Prinsip

Prinsip dari analisa ini adalah dengan menuangkan BPA kedalam cawan yang stereil, biarkan membeku dan sebarkan sample sebanyak 1 ml ke dalam media yang telah siap tersebut.Sedangkan konfirmasi koloni Staphylococcus aureus dengan menggunakan metode koagulasi dan uji tambahan. Metode ini cocok untuk mengetahui makanan yang diduga mengandung koloni lebih dari 100 Staphylococcus aureus/g.

b. Peralatan

· Autoclave

· Alat hitung koloni

· Timbangan analitik

· Botol pengencer

· Batang gelas bengkok

· Blender

· Cawan petri

· Gelas ukur

· Gelas preparat

· Incubator

· Membrane apparatus

· membran filter

· pipet gelas

· waterbath

· Pipet Pasteur

c. Media

· BPA

· BHIB

· Coagulase plasma dengan EDTA

· Larutan Butterfild phosphat buffered

· Paraffin oil steril

· Pereaksi pewarnaan gram

· Pereaksi katalese

· Purple Carbohydrate Broth

· Toluidine blue

· Trypticase

d. Kondisi pengujian

Kondisi pengujian harus dalam kndisi steril baik personal, peralatan dan lingkungan harus dalm kondisi steril agar sample yang dianalisa idak terkontaminasi. Media yang dikgunakna harus dalam kondisi kering ketika ingin dibuat. Bila Staphylococcus aureus tidak tumbuh dalm waktu 48jam maka dapat dilanjut sampai 72 jam

e. Prosedur

· Potong kecil-kecil sample yang telah diambil secara acak

· Timbang sample hingga 25 g

· Masukan dalam wadah / plastic steril

· Tambahkan larutan 225 ml Butterfild phosphat buffered homogenkan selama 2 menit( homogenate ini merupakan larutan pengencer 10¹

· Kemudian lakukan pengenceran hingga pengenceran kelima

· Kemudian isolasi Staphylococcus aureus dengan menggunakn cawan dan retaken dangan menggunakan gelas bengkok dan iarkan selama 48 jam.

· Lakukan perhitungan koloni

· Ambil dua atau lebh koloni terduga unuk dilakukan uji koagulase dan uji tambahan

· Lakukan uji koagulase

· Lakuka uji tambahan

Apabila tidak terbentuk koagulan maka negative mengadung Staphylococcus aureus